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Angew. Chem. | 劉臻課題組開發(fā)非天然苯胺合成酶（Aniline Synthase）
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Introduction
苯胺類化合物作為關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元，普遍存在于藥物分子及其他活性物質(zhì)中，同時是多種工業(yè)材料制備的核心中間體。根據(jù)Transparency Market Research發(fā)布的《2021–2031年全球苯胺衍生物市場預(yù)測報告》顯示，至2031年全球苯胺類衍生物的市場價值將達到110億美元。因此，開發(fā)芳胺骨架的高效合成方法在藥物開發(fā)和材料科學等領(lǐng)域至關(guān)重要。傳統(tǒng)的苯胺類化合物的工業(yè)合成工藝主要以苯或其衍生物出發(fā)，通過苯環(huán)硝基化反應(yīng)以及隨后的硝基苯催化加氫獲得苯胺。在醫(yī)藥中間體合成領(lǐng)域，過渡金屬催化的C–N鍵偶聯(lián)反應(yīng)同樣被廣泛應(yīng)用，這類方法的發(fā)展對于藥物分子的構(gòu)建具有關(guān)鍵意義。盡管這些經(jīng)典方法目前仍無可替代，科研工作者持續(xù)致力于探索更加綠色溫和、可持續(xù)的合成體系，從而最終避免使用高溫高壓的反應(yīng)條件，或者高成本且具有生理毒性的過渡金屬催化劑。本研究聚焦生物酶催化體系的開發(fā)，通過定向進化初步驗證了該策略合成苯胺類化合物的可行性。值得注意的是，相較于自然界中存在的基于P450體系的苯胺合成酶，這一生物催化體系展現(xiàn)出截然不同的催化機制，為酶催化在苯胺合成領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的突破方向。
2025年4月7日，北京生命科學研究所 / 清華大學生物醫(yī)學交叉研究院劉臻課題組在國際期刊《Angewandte Chemie International Edition》發(fā)表了題為“An Enzymatic Platform for Aniline Synthesis through Oxidative Amination”的研究論文。通過改造該實驗室開發(fā)的黃素（FMN）依賴酶PtOYE（源自Parageobacillus thermantarcticus），這一催化體系可以有效地將胺類化合物和環(huán)己酮衍生物組合，通過氧化胺化的機制制備多種二級和三級苯胺。針對結(jié)構(gòu)不同的胺類底物，作者分別通過兩條定向進化路徑獲得了各自的優(yōu)勢突變體OYE_G3和OYE_M3，提高了酶催化的效率并抑制了環(huán)己酮直接脫氫生成苯酚的副反應(yīng)。通過多組動力學實驗，作者系統(tǒng)研究了這類苯胺合成酶的催化機制。實驗表明，優(yōu)勢突變體不僅提高了亞胺中間體芳構(gòu)化的催化效率，且降低了環(huán)己酮直接脫氫生成苯酚的活性，形成了有利于目標反應(yīng)的協(xié)同效應(yīng)。
圖1
苯胺類化合物的生物合成新策略
苯胺合成酶(Aniline Synthase)的開發(fā)過程
研究初期，作者首先對野生型黃素酶及其突變體的亞胺脫氫芳構(gòu)化活性進行了系統(tǒng)性篩選。實驗數(shù)據(jù)顯示，課題組現(xiàn)有酶庫中的OYE_G0突變體對于目標反應(yīng)具有顯著的初始活性，能夠以最高的轉(zhuǎn)化率（38%）催化生成目標產(chǎn)物3aa且目標產(chǎn)物與副產(chǎn)物4a的比例最優(yōu)，體現(xiàn)了這類脫氫酶具有被進一步優(yōu)化的潛力。
基于這一發(fā)現(xiàn)，研究人員隨后利用OYE_G0作為起始模版，分別針對二級苯胺和三級苯胺的合成過程進行了多輪蛋白質(zhì)工程化改造與篩選。通過多個活性位點的定點飽和突變以及隨機突變，作者最終分別獲得催化合成二級苯胺的突變體OYE_G3以及催化合成三級苯胺的優(yōu)勢突變體OYE_M3。
圖2
針對二級與三級苯胺分別開展的蛋白質(zhì)工程化改造
酶催化苯胺合成反應(yīng)的底物探索與合成應(yīng)用
在確定了最優(yōu)酶突變體和最適反應(yīng)條件之后，研究人員系統(tǒng)地研究了這些苯胺合成酶的底物適用范圍。結(jié)果表明，這種生物催化方法展示出了良好的底物兼容性和官能團耐受性，可以將不同取代的芐胺、含雜環(huán)的伯胺以及部分烷基胺轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的二級苯胺；也可成功地將部分仲胺轉(zhuǎn)化為三級苯胺。此外，不同取代模式的環(huán)己酮也能參與反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，作者選取多個底物進行了制備規(guī)模的酶促反應(yīng)，成功合成出如3ad、3ao等多種苯胺衍生物，進一步驗證了該方法的應(yīng)用潛力。
圖3
底物適用性拓展與部分放大試驗
酶促反應(yīng)的機制研究過程
為了深入了解這一酶促反應(yīng)的機理，作者對生物催化脫氫偶聯(lián)反應(yīng)進行了一系列動力學研究。首先，研究人員使用二級苯胺合成酶進化譜系中的各個變體針對3aa的酶催化合成進行了時間進程實驗，并通過Michaelis-Menten曲線分析酶的動力學參數(shù)。實驗結(jié)果表明定向進化引入的突變有效地提高了苯胺合成酶OYE_G3的kcat。隨后，作者用類似的方法對三級苯胺3ca的合成反應(yīng)進行了時間進程研究。與二級苯胺合成體系不同是，三級苯胺合成反應(yīng)的前期會發(fā)生可逆的aza-Michael加成過程形成中間體6b，因此反應(yīng)會顯示出明顯的誘導期（induction period）。為了明確探究酶活性是否從環(huán)己酮脫氫轉(zhuǎn)移到亞胺脫氫，作者比較了最初變體（OYE_G0）與定向進化譜系的兩個最終變體（OYE_G3和OYE_M3）生成苯酚的活性變化（圖4e和4f）。實驗結(jié)果表明，進化后的變體對于苯酚生成過程的催化能力顯著下降。
圖4
苯胺合成酶系統(tǒng)的動力學研究
圖5
酶催化苯胺合成反應(yīng)的推測過程
基于黃素依賴酶的獨特脫氫催化機制，作者開發(fā)了非天然的苯胺合成酶系統(tǒng)，可以有效地制備二級與三級苯胺衍生物。這種酶催化系統(tǒng)可以通過后續(xù)的進化進一步提高催化效率，并通過計算與實驗結(jié)合的方式完善機制研究。總體而言，這項工作為苯胺化合物的合成提供了高效、環(huán)境友好的生物合成策略，在生物催化和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。
本項目的實驗部分主要由劉臻實驗室北師大學籍研究生趙翔完成。本研究得到科技部、清華大學生物醫(yī)學交叉研究院以及北京生命科學研究所的資助。
論文鏈接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202505252
